Comment procéder au remplissage d’une colonne en verre SNAP® avec les résines d’exclusion de Bio-Works : WorkBeads 40 SEC, WorkBeads 40/100 SEC and WorkBeads 40/10000 ?
Suivez simplement notre guide !
Préparation :
Solutions de remplissage
Nous recommandons un tampon de remplissage neutre contenant environ : NaCl 100 mM, 0,05% Tween-20. Exemple : 10 mM Na-phosphate, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4
Il est également possible d’utiliser uniquement de l’eau.
Préparation de la suspension de gel
Verser une quantité de billes légèrement supérieur au lit de gel désiré dans un filtre en verre n°3 posé sur un erlen à vide. Pour éliminer le tampon de stockage des billes, laver avec 4 volumes d’eau puis avec 3 volumes de tampons de remplissage. Transférer le gel (X ml) dans un flacon gradué, ajouter 1,43 volume de tampon de remplissage (X x 1,43) (suspension à 70%).
Solution de stockage
Une solution à 20% ethanol est recommandée. Tout autre conservateur peut être utilisé.
Equipement
1- Utiliser une colonne SNAP® Essential Solution. Une hauteur de lit de gel de 90-100 cm est recommandée pour les gels WorkBeads 40 SEC, 40/100 SEC et 40/1000 SEC. La dimension de la colonne est choisie en fonction du volume d’échantillon à séparer. Celui ci ne doit pas excéder 1-4% du volume de gel, sinon la résoluton est déteriorée.
2- Calculer le débit maximum dans la colonne choisie :
Fmax (du support (ml/min)) = Débit linéaire max x (diamétre colonne)² x π/4 [ml/min]
Exemple : pour une colonne de 25 mmm de diamètre interne et un debit linéaire max de 10 cm/min (pour WorkBeads 40 SEC, 40/100 SEC et 40/1000 SEC) :
Fmax = 10 cm/min x (2,5 cm)² x π/4 = 49 ml/min
NB : Vérifier que la pression résultante n’est pas supérieure à la pression maximum supportée par la colonne. Réduire le débit si c’est le cas.
3- Déterminer le debit de remplissage : celui ci doit être de 75% de Fmax
Débit de remplissage = 0,75 x Fmax
4- Regrouper et laver l’équipement necessaire au remplissage : colonne compléte, reservoir de remplissage, pompe ou système chromatographique et tampon. Le réservoir de remplissage doit être de même diamétre que la colonne et, au minimum, de même longueur.
5- Vérifier que la pompe peut donner le débit de remplissage. Ne pas oublier de bloquer la pression max du système chromatographique.
6- Marquer sur la colonne la hauteur de lit de gel désirée.
Remplissage de la colonne:
Protocole de base.
Pour un remplissage de meilleur qualité, l’optimisation des paramètres est nécessaire.
1- Remplir le système chromatographique ou la pompe avec le tampon de remplissage.
2- Verser 1-2 ml de tampon de remplissage dans la colonne. Éliminer l’air du connecteur bas de la colonne en aspirant le tampon par le tube de sortie avec une seringue. Fermer la sortie basse de la colonne en laissant environ 1 cm de solution au dessus du fritté.
3- Connecter le réservoir de remplissage
4- Homogénéiser le gel en suspension et le verser avec précautions dans le réservoir. Pour éviter la formation de bulles d’air, le réservoir doit être rempli à ras bord (le ménisque doit être au-dessus du bord supérieur de la colonne). Fermer le réservoir en prenant soin de mouiller avec de l’éthanol 20% tous les éléments en contact avec les tampons et enfin, connecter la pompe.
5- Ouvrir le bas de la colonne
6- Commencer le remplissage en appliquant le débit pré-déterminé et laisser le gel sédimenter. Le débit est appliqué jusqu’à ce que hauteur de lit de gel et pression soient constants. Ceci peut prendre 1-2 heures en fonction des dimensions de la colonne. Marquer la hauteur de lit de gel quand celle ci est constante.
7- Arrêter le flux. Enlever le réservoir.
NB : le gel peut se décompresser quand le flux est stoppé.
8- Si la hauteur de lit est trop grande, enlever l’excès de résine avec précaution en re-suspendant le gel par le haut et en pipetant l’excès.
9- Remplir la colonne à ras bord avec le tampon de remplissage bord (le ménisque doit être au-dessus du bord supérieur de la colonne), mettre en place le connecteur.
10- Remettre le flux, quand la hauteur de lit de gel est constant, arrêter le flux et fermer le bas de la colonne très rapidement. Descendre le piston et l’ajuster 2-5 mm plus bas que la hauteur de lit marquée précédemment.
11- Laver la colonne avec 2 volumes de colonnes d’eau.
12- Mesurer l’efficacité et l’asymétrie de la colonne en utilisant 1 ml de tampon eau/acétone 1-4% à un débit de 1-2 cm/min :
Calcul du nombre de plateaux théorique (N):
N = 5.54 × (T1/W1/2)
T1: temps de rétention – W1/2 : largeur du pic à mi-hauteur
HETP = L/N
L : longueur de la colonne (mm)
Calcul de la symétrie de pic (S):
S = W1/2r/W1/2l
W1/2,r : Largeur du pic à mi-hauteur à la droite de la médiane du pic
W1/2,l : Largeur du pic à mi-hauteur à la gauche de la médiane du pic
Ces données (N et S) sont à mesurer régulièrement pour s’assurer que la colonne est toujours opérationnelle.
13- Mettre en œuvre la colonne ou bien pour la stocker, l’équilibrer avec un tampon Éthanol/eau 20% à un débit inférieur à 4 cm/min.
Sécurité
Reportez-vous à la fiche MSDS des WorkBeads SEC ainsi que les instructions de tous les équipements utilisés.
En savoir plus :
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